Summary: Después de que un laboratorio obtiene una nueva línea celular, la línea celular primero debe cultivarse y expandirse y luego congelarse. La crioconservación de células se puede utilizar en primer lugar como respaldo cuando las células se......
Después de que un laboratorio obtiene una nueva línea celular, la línea celular primero debe cultivarse y expandirse y luego congelarse. La crioconservación de células se puede utilizar en primer lugar como respaldo cuando las células se pierden debido a la contaminación y otras condiciones. Además, casi todas las células sufren cierto grado de variación durante el proceso de cultivo y pase. Para mantener la consistencia de los resultados experimentales, generalmente las células no se pueden cultivar durante docenas de generaciones. Si se utiliza de nuevo, es necesario descongelar y cultivar las células menos pasadas y crioconservadas antes de su uso.
Hay cuatro puntos principales en el proceso de congelación de células: recolección de células, uso de agentes protectores, tasa de congelación y ambiente de almacenamiento.
Cosecha de células
Las células utilizadas para la crioconservación se seleccionan generalmente cuando las células tienen una confluencia de aproximadamente el 90%. En este momento, el crecimiento celular es bueno y la cantidad de células es grande, y el medio de cultivo debe cambiarse 24 horas antes de recolectar las células. El método de recolección de las células para la crioconservación es el mismo que el habitual. Centrifugar a 100xg durante 5 minutos para recoger las células y resuspenderlas. Se cuentan las células vivas. Diluir o concentrar al doble de la concentración celular final para la conservación celular (normalmente 4-10 millones de células/ml), añadir un volumen igual de la solución de mezcla del agente protector del medio de cultivo que se ha preparado, mezclar suavemente y dividir en alícuotas en el tubo de crioconservación. crioconservación
Uso de agentes protectores.
En la crioconservación celular, el DMSO se usa generalmente como agente protector. En la crioconservación de células, la concentración final de DMSO utilizada es generalmente del 5 al 15 %. La concentración de DMSO en la solución de crioconservación de una célula específica se puede encontrar en la ATCC. Para células particularmente sensibles, especialmente células de hibridoma, puede ser mejor usar suero al 95 % y DMSO al 5 % al criopreservar. Cuando utilice el agente protector, use medio de cultivo o suero para duplicar la concentración final y luego mézclelo con un volumen igual de medio de cultivo de células en suspensión. Tasa de congelación celular
La velocidad de congelación de las células se controla mejor para permitir suficiente tiempo para que las células se deshidraten sin dañarse por una deshidratación excesiva. Para la mayoría de las celdas, es adecuada una caída de temperatura de 1 a 3 °C por minuto. La operación habitual es poner las celdas a -20°C durante 1-2 horas, luego ponerlas en el refrigerador a -80°C durante la noche (si no hay refrigerador a -80°C, puede usar hielo seco en su lugar), y luego transfiéralo al tanque de nitrógeno líquido o por debajo de -130 Almacenamiento a largo plazo en el refrigerador a ℃.
Entorno de almacenamiento
La temperatura de almacenamiento a largo plazo de las celdas es de -130 ℃ o menos. La temperatura de la capa gaseosa en el tanque de nitrógeno líquido está entre -140 ℃ y -180 ℃. Las células pueden almacenarse en la capa gaseosa o sumergirse en nitrógeno líquido. Si es posible, es mejor almacenar en la capa gaseosa, ya que puede evitar que el nitrógeno líquido ingrese al almacenamiento de congelación. El tubo provoca una explosión cuando se extraen las células (pero de esta manera, solo se puede almacenar una pequeña cantidad de nitrógeno líquido en el tanque de nitrógeno líquido, que debe agregarse con frecuencia). Las celdas también se pueden almacenar en el refrigerador a -80 ℃ durante unos meses más o menos.
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