1. Las células a criopreservar deben estar en buen estado de crecimiento (fase logarítmica) y alta tasa de supervivencia, con una densidad de alrededor del 80-90%.
2. Compruebe si las células aún conservan sus propiedades únicas antes de congelarlas.
Por ejemplo, el hibridoma debe analizarse para determinar la producción de anticuerpos uno o dos días antes de la crioconservación.
3. Preste atención a la calidad del crioprotector.
El DMSO debe ser de grado reactivo, estéril e incoloro (filtrado con teflón FGLP de 0,22 micras o productos estériles comprados directamente, como Sigma D-2650), alícuotas en pequeños volúmenes de 5-10 ml, almacenados a 4 oC en la oscuridad. No descongelar varias veces. El glicerol también debe ser de grado reactivo y almacenarse en la oscuridad después del autoclave. Úselo dentro de un año después de abrirlo, ya que será tóxico para las células después de un almacenamiento a largo plazo.
4. Concentración celular para crioconservación:
(1) fibroblastos humanos normales: 1~3 x 106 células/ml
(2) Hibridoma: 1~3 x 106 células/ml, la concentración de células no debe ser demasiado alta, algunos hibridomas morirán después de 24 horas de descongelación debido a la alta concentración de congelación.
(3) Líneas tumorales adherentes: 5~7 x 106, según el tipo de célula. El adenocarcinoma requiere una mayor concentración después de la descongelación, mientras que HeLa solo necesita 1-3 x 106 células/ml.
(4) otras suspensiones: 5~10 x 106 células/ml, los linfocitos humanos deben ser al menos 5 x 106 células/ml.
5. La concentración de crioprotector es 5 o 10 % de DMSO. Si las condiciones de congelación de las células son inciertas, se debe usar un cultivo de respaldo mientras se crioconserva para evitar fallas en la congelación.
6. Método de congelación:
(1) Método tradicional: 4 oC 10 minutos ---> -20 oC 30 minutos ---> -80 oC 16-18 horas (o toda la noche) ---> Almacenamiento a largo plazo en la fase de vapor del tanque de nitrógeno líquido .
(2) Enfriamiento del programa: use una máquina de enfriamiento de velocidad constante para reducir la temperatura ambiente a –120 oC a una velocidad de –1 ~ -3 oC/min, y guárdelo en la fase de vapor de un tanque de nitrógeno líquido durante mucho tiempo. almacenamiento a plazo. Es adecuado para la conservación de células en suspensión e hibridomas.
7. Materiales:
(1) Células cultivadas que crecen bien
(2) medio fresco
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Tubo de crioconservación de plástico estéril (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4 % p/v de azul tripán (GibcoBRL 15250-061)
(6) Placa de hemocitómetro y cubreobjetos
(7) Máquina de enfriamiento de velocidad constante (KRYO 10 Serie II)
8. Pasos:
(1) Cambie la mitad o la cantidad total de medio un día antes de la congelación y observe el crecimiento celular.
(2) Preparación de la solución de crioconservación (preparación antes del uso): Agregue DMSO al medio fresco, la concentración final es 5-10%, mezcle bien y póngalo a temperatura ambiente para su uso posterior.
(3) De acuerdo con la operación de subcultivo celular, recolecte las células cultivadas y tome una pequeña cantidad de suspensión celular (alrededor de 0,1 ml) para contar la concentración celular y la tasa de supervivencia antes de la congelación.
(4) Centrifugue, elimine el sobrenadante, agregue una cantidad apropiada de solución de crioconservación para que la concentración celular sea de 1-5 x 106 células/ml, mezcle bien y dispense en el tubo de crioconservación etiquetado, 1 ml/vial, y tome una pequeña cantidad. cantidad de suspensión celular para la detección de contaminación.
(5) Método de crioconservación 1: el criotubo se coloca a 4 oC durante 10 minutos → -20 oC durante 30 minutos → -80 oC durante 16 a 18 horas (o toda la noche) → fase de vapor del tanque de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
(6) Método de almacenamiento en congelación 2: el tubo de congelación se coloca en una máquina de enfriamiento de velocidad constante con un programa establecido y luego se coloca en un tanque de nitrógeno líquido.
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